专业要求：大黄素联合阿霉素诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的试验研究

[摘要]：目的：探讨大黄素联合阿霉素抑制人胃腺癌细胞SGC-7901生长作用的机制。方法：体外常规培养人胃癌细胞株SGC-7901，并分为阿霉素组(5μg /mL) 、大黄素组(80 μm o l/ L) 、联合组(阿霉素5 μg /mL +大黄素80 μm o l/ L)、和阴性对照组。然后采用MTT法检测胃癌细胞SGC-7901增殖的情况，采用Annexin V/PI双标记法和DNA琼脂糖凝胶电泳技术检测巨噬细胞的凋亡情况。结果：与阿霉素组及大黄组相比，联合组SGC-7901 细胞存活率明显降低，细胞凋亡率明显升高。结论：大黄素联合阿霉素可增加化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用，其机制部分与促进细胞凋亡有关。
材料与方法
一、实验材料
1． 主要试剂: RPMI1640培养液（美国 GIBGO 公司）、胎牛血清(特优级，美国 GIBGO 公司)、噻唑蓝 (美国 Sigma 公司)、二甲基亚砜(DMSO) (苏州阿尔发生物科技有限公司)、胰酶（美国 Sigma 公司）、Annexin V FITC/PI流式凋亡试剂盒（美国 BD 公司）、基因组DNA小量抽提试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）、大黄素（苏州阿尔发生物科技有限公司）、阿霉素（苏州阿尔发生物科技有限公司）。
2．癌细胞来源：人胃癌细胞SGC-7901来源于上海长海医院消化内科实验室。
3．细胞培养：胃癌细胞SGC-7901 培养于含10% 胎牛血清、100 Ui /mL 青霉素和100 ug /mL 链霉素的RPMI1640培养液中, 细胞在相对湿度为95%、37℃、5%CO2 的环境中单层生长, 取对数生长期细胞用于实验。
二、实验方法
1.MTT法检测肿瘤细胞的杀伤作用
用含10％胎牛血清的培养液配成单个胃癌SGC-7901细胞悬液，以每孔104个细胞接种至96孔板，每孔体积200μl；培养细胞：在37℃、5%CO2孵箱孵育24h；加药：随后加入不同剂量的干预药物；呈色：培养 12h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4) 20μl，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解；比色：选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，本实验重复三次。
2.流式细胞术检测细胞凋亡
经不同干预药物干预24h后， 冰磷酸盐缓冲液洗涤细胞2 次，离心后200μl 结合缓冲液重悬细胞， 加5μl Annexin V FITC 及10μl 碘化丙啶( PI) ， 避光反应15 min，加300 μl 结合缓冲液，上流式细胞仪检测。每组重复3 次，取均值。
结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳
按细胞DNA提取试剂盒说明书进行。在细胞受药物干预后24 h从6孔板上消化下来并收集于1.5mLEP管中，12 000 r /min常温下离心10min，弃上清，用预冷的PBS液重悬细胞，同上离心后弃上清。依据试剂盒抽提细胞DNA后，取10μL与2μL点样缓冲液混合，上样于1. 2% 的琼脂糖凝胶，50 V 电泳2 h ，凝胶成像系统拍照记录结果。
三 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，所有数据均用±s表示，采用ANOVA程序进行单因素方差分析、Univariate程序进行多因素方差分析，P<0.05表示差异具有显著性。